确诊伤寒最可靠的依据是血培养，培养出伤寒杆菌，可以确定伤寒杆菌感染的诊断。一般是在起病的初期，第1-2周这个期间做血培养，阳性率比较高。如果在这个期间已经应用了抗菌药物的治疗，一般血培养的阳性率就会有所下降，这种情况可以进行骨髓的培养，骨髓的培养对于抗生素的应用不受影响。
对于粪便培养伤寒杆菌，在发病的第3-4周可以出现阳性率，但粪便当中因为细菌比较多，所以通常不采取粪便培养的形式来帮助诊断伤寒杆菌感染。除了培养伤寒杆菌以外，还可以结合肥达反应试验来辅助诊断伤寒，如果是肥达反应O抗体达到了1:80以上，鞭毛抗体达到1:160以上，也可以辅助诊断伤寒。如果是依靠肥达反应，必须还要结合患者的临床表现以及血常规的检查，综合来分析、判断是否是伤寒杆菌的感染。