1、腹部立位X线片：腹部立位平片用于观察患儿是否出现低位结肠梗阻，如有低位结肠梗阻则钡剂灌肠侧位和前后位照片中可见到典型的痉挛肠段和扩张肠段，排钡功能差，24小时后仍有钡剂存留，新生儿时期扩张肠管多于生后半个月方能对比见到。
2、活体组织检查：取距肛门4cm以上直肠壁粘膜下层及肌层一小块组织，检查神经节细胞的数量。
3、肛门直肠测压：测定直肠和肛门括约肌的反射性压力变化，可诊断先天性巨结肠和鉴别其他原因引起的便秘。在正常小儿和功能性便秘，当直肠受膨胀性刺激后，内括约肌立即发生反射性放松，压力下降，先天性巨结肠患儿内括约肌非但不放松，而且发生明显的收缩，使压力增高。此法在10天以内的新生儿有时可出现假阳性结果。
4、直肠黏膜组织化学检查法：根据痉挛段粘膜下及肌层神经节细胞缺如处增生、肥大的副交感神经节前纤维不断释放大量乙醯胆碱和胆碱酶，经化学方法可以测定出两者数量和活性均较正常儿童出5～6倍，有助于对先天性巨结肠的诊断，并可用于新生儿。
5、盆腔MRI、CT：盆底MRI和CT三维重建等不但能了解畸形的位置高低，而且能诊断骶椎畸形及观察骶神经、肛提肌、肛门外括约肌的发育情况。
6、瘘管造影：显示造影剂注入时的结肠影像及造影剂排出时的直肠瘘管影像，可明确显示直肠瘘管与尿道的关系。