目前新生儿胆道闭锁的确诊属于世界性难题，无特异性检查可以确诊胆道闭锁，比较多见的是实验室检查。胆道闭锁通常表现为中度或者高度的直接胆红素升高，占总胆红素水平的50%-80%；转氨酶正常或轻度增高，γ谷氨酸肽酶明显增高，血清胆红素水平持续不变或进行性升高。特别是当直接胆红素占总胆红素60%以上，是诊断胆道闭塞最重要的实验室检查。

较多用的还有影像学检查，胆总管闭锁伴囊性扩张具有诊断意义，同时可以帮助排除先天性胆管扩张症和其它胆道畸形，放射性核素扫描可以区分肝细胞功能障碍和胆道梗阻。CT、ERCT、MRCT与超声相比，在胆道闭锁的诊断方面并不具有优势。

目前国际上对婴幼儿应用CT的放射暴露已经逐渐得到重视，建议不要轻易进行CT检查，开腹和腹腔镜技术实施胆道造影检查是确诊的唯一方法，造影可以清晰显示肝内外胆道情况。胆囊穿刺为白胆汁，胆囊置管注入浓度30%左右的碘海醇注射液或者泛影葡胺，胆总管远端通畅而近端未显影，需压迫胆管再次造影，若无肝内胆管显影则诊断为胆道闭锁。肝门部有囊肿可直接穿刺囊肿造影，胆囊比较塌陷无法置管时可诊断为胆道闭锁。其他检查包括经皮肝穿刺、十二指肠引流液分析等，但临床应用比较少。