乳糖不耐症诊断主要是依赖于患者摄入过量的乳制品后出现的胃肠道反应，协助诊断乳糖不耐症史，可以进行下列四种医学测试之一。
隔夜进食后摄入25g的乳糖，比如可口服的乳糖水溶液。如果这些乳糖无法被消化，就会在肠道细菌的代谢下产生氢气或甲烷，而这两种气体可由临床气相色谱仪等医疗器械检查出来，整个检测过程需要2.5个小时。如果病人呼吸中的氢气或甲烷含量高，就提示乳糖不耐的几率大，这是目前最为准确的乳糖不耐的检测方法。但由于这种测试可能导致严重腹泻，所以通常不对婴幼儿使用。此外的三种方法也可以用于诊断乳糖不耐症，包括粪便酸碱性测定、肠道病理切片等方法，但最为准确的是第一种方法。