支原体感染一般2-3周可以被检查出来，支原体的潜伏期较长，一般潜伏2-3周，发病前2-3天直至病愈数周均可在呼吸道分泌物中发现支原体。起病后两周，约2/3的病人冷凝集试验阳性，滴定效价＞1:32，链球菌MG凝集试验效价≥1：40，连续两次四倍上增高有诊断的价值。特别是当滴度逐渐升高时，有诊断价值。
支原体感染的诊断还包括血常规检查、病原学检查、PCR检查。血常规检查可见白细胞总数正常或稍增多，以中性粒细胞为主。病原学检查通过留取痰、鼻和咽拭子、宫颈口、尿液等处的标本，将标本送细菌培养，培养分离出支原体对诊断具有决定性的意义。普通PCR技术检测支原体特异性DNA具有快速、简便、特异的优点，敏感性高于细胞分离技术，用套式PCR检测可显著提高其敏感性。