支原体感染一般2-3周可以被检查出来，支原体的潜伏期较长，一般潜伏2-3周，发病前2-3天直至病愈后数周，均可在呼吸道分泌物中发现支原体。起病后两周约2/3的病人为冷凝集试验阳性，滴定效价>1:32，链球菌MG凝集试验效价≥1:40，连续两次呈四倍以上增高，则有诊断价值。特别是当滴度逐步升高时，具有诊断价值。
支原体感染的诊断还包括血常规检查、病原学检查、PCR检查。血常规检查可见白细胞总数正常或稍增多，以中性粒细胞为主。病原学检查通过留取痰、鼻和咽拭子，以及宫颈口、尿液等处的标本，将标本送细菌培养，培养分离出支原体，对诊断具有决定性的意义。普通PCR技术检测支原体的特异性DNA，具有快速、简便、特异的优点，敏感性高于细胞分离技术，用套式PCR检测可显著提高其敏感性。