前列腺癌穿刺活检是诊断前列腺癌最可靠的方法，通常最常用的方式是超声引导下经直肠穿刺活检，以及经会阴穿刺活检。经直肠操作简单，且手术时间短，无需麻醉，缺点是感染并发症比较高，检出率相对较低，需要进行肠道准备和口服抗生素的预防，在直肠探头的引导下将穿刺针穿入前列腺组织当中，取10-12穿刺点。经会阴穿刺能够有效获得前列腺各区域的组织，提高检出率，并发症发生率低，不过缺点是需要局部麻醉，疼痛感会增加，技术要求相对比较高。
除此以外，近年来靶向穿刺也逐渐开始趋于广泛，可以经多参数核磁共振引导下，进行前列腺的靶向穿刺，精确度更高，在比较基层的单位、设备缺乏的地区，也可以直接用手指引导下经直肠穿刺活检。