腰椎穿刺主要选择腰3-4间隙，根据情况，也可以上移或者下移一个间隙作为穿刺点。间隙的定位主要在两侧髂嵴之间做连线，此连线与脊柱的相交处即为第四棘突或者腰3-4棘突间隙。
腰椎穿刺必须在严格无菌条件下进行，穿刺时病人取侧卧位，双膝弯曲，大腿向腹壁靠拢，头部向胸部屈曲，以便使腰背部尽量向后弓曲，能够将棘突间隙张开，以利于穿刺。在摸清腰3-4棘突间隙后，可以使用局麻药物在间隙正中做皮丘，达到浸润麻醉的效果，使用腰椎穿刺针刺过皮丘，进入腰椎间隙。