亚叶酸钙主要是用于甲氨蝶呤的解救，它参与多种的代谢反应，比如对于嘌呤、嘧啶和氨基酸的代谢都具有较为重要的调控作用。亚叶酸钙在临床上主要可以用于细胞毒治疗中的解毒治疗，适合用于高剂量的甲氨蝶呤患者的后续解毒治疗，还可以用于由治疗甲氨蝶呤过量使用所导致的不良反应。

亚叶酸钙还可以和氟尿嘧啶联合用于结直肠癌的患者，还可以用于巨幼细胞性贫血的患者，主要用于叶酸治疗效果不佳的巨幼细胞性贫血，但是不适合用于维生素B12缺乏的贫血。总之亚叶酸钙最主要的作用是用于甲氨蝶呤的解毒。