库欣综合征的诊断包括功能诊断和病因诊断两部分，当患者存在典型库欣综合征的症状体征，或者临床疑似时，首先测定24小时尿游离皮质醇和24小时血皮质醇昼夜节律，如果尿游离皮质醇升高并且血皮质醇昼夜节律消失，即高度怀疑库欣综合征。此时行小剂量地塞米松抑制试验，如果不能抑制，即可确立库欣综合征的诊断。
确立库欣综合征诊断之后，应首先行大剂量地塞米松抑制试验，如果能抑制即提示垂体来源，如果不能抑制行肾上腺影像学检查，即可发现肾上腺来源的库欣综合征。如果不能抑制并且ACTH水平升高，即应通过综合多方面手段，寻找异位ACTH综合征的原发肿瘤进行定位。