1、查体：检查患儿的身体是否存在异戊酸血症的相关体征。
2、尿液及血液有机酸分析：正常人尿中异戊酸浓度低于2μmol/L，患者异戊酸排泄量为8~300μmol/d，3-羟基异戊酸、异戊酰甘氨酸及其代谢产物亦显著增高。正常血浆异戊酸浓度低于10μmol/L，异戊酸血症患者血浆异戊酸浓度可为10~50μmol/L，急性发作期浓度高达600~5000μmol/L，伴特殊“汗脚”气味。
3、一般化验：血液及尿液常规、血气分析、血糖、氨、肝肾功能等检査对病情评估很有帮助，患者常合并代谢性酸中毒、酮症、高氨血症、低钙血症、血小板减少、中性粒细胞减少和全血细胞减少。
4、血液酯酰肉碱谱分析：正常人血液异戊酰肉碱浓度多低于0.5μmol/L，患者血液异戊酰肉碱显著增高，游离肉碱降低，异戊酰肉碱/乙酰肉碱比值增高。
5、酶学分析：患者皮肤成纤维细胞及外周血白细胞异戊酰辅酶A脱氢酶活性下降，为正常的0%~13％，残余酶活性与临床严重程度无关。
6、基因诊断：异戊酰辅酶A脱氢酶的基因突变，具有确诊意义。