苯丙酮尿症的诊断一方面要结合临床表现，比如像生长发育迟缓，精神、神经症状，皮肤毛发的损害，也需要进行各项检。其中主要是新生儿的筛查，是我们国家需要强制进行。新生儿喂奶三天以后，采集足跟末梢血吸收在再生的厚滤纸上，晾干以后邮寄到筛查中心，采用特殊的方法测定苯丙氨酸的含量。如果大于0.24mmol/L相当于大于4mg/dL，也就是两倍于正常的参考值，应该进一步的复查并且采静脉血定量的测定苯丙氨酸和酪氨酸。
正常人苯丙氨酸的浓度波动在0.06-0.18mmol/L，相当于波动在1-3mg/dL。但是患儿血浆苯丙氨酸可以高达1.2mmol/L，相当于大于20mg/dL以上，同时血中标本酪氨酸正常或者是稍低，我们需要结合像尿三氯化铁试验、血浆氨基酸的分析、尿液有机酸分析，也需要进行酶学的检查以及DNA的检查，还有其他辅助的检查，包括脑电图，甚至X线检查。