1、皮肤组织病理：菌体主要位于巨噬细胞内，Grocott染色菌体呈桑葚状，菌体细胞圆形或椭圆形，大小形态较规则，少数腊肠细胞和包内横隔。
2、真菌培养：是诊断本病的金标准，敏感性比较高。一般根据双相性特点，即在25℃时为菌丝相，在37℃时为酵母型。在25℃培养时可产生红色可溶性色素和裂殖前形成横隔，在37℃时见圆形、椭圆形、酵母细胞，有的细胞有横隔等特点。
3、影像学检查：肺部及关节X线，还有肝、胆、脾、超声以及CT检查，可以了解胸部、腹部病变情况，判断是否是其他原因导致的。
4、实验室检查：血常规、血沉等检查。已确诊马尔尼菲青霉感染，需行HIV抗体检测，必要时应反复检测，以免漏诊艾滋病。