诊断非结核性分枝杆菌主要靠非结核性分枝杆菌菌种鉴定。
1、细菌学检查：对疑为非结核性分枝杆菌病患者可取痰液、血液、脑脊液进行细菌学培养，如抗酸染色阳性， 2～3次培养为同一种非结核性分枝杆菌，即可诊断。
2、病理学检查：非结核性分枝杆菌淋巴结炎病理学特征为肉芽肿性炎症，可取病理组织进行活检明确诊断。
3、分子生物学检查：作非结核性分枝杆菌菌种培养鉴定，本方法准确度高、快速、灵敏、简便。
4、Mantoux皮肤试验：PPD-非结核性分枝杆菌皮试后出现硬结直径比PPD-T皮试大5mm或25%以上，则临床上可诊断是非结核性分枝杆菌感染。
5、X线检查：多为肺上叶薄壁空洞，单发或多发。空洞周围少有浸润病变，结节性阴影不多见。无支气管播散，胸膜纤维增生性反应和胸水少见。