1、常规实验室检查：可有低酮症性低血糖，急性发作时有代谢性酸中毒，肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、天冬氨酸氨基转移酶及丙氨酸氨基转移酶升高。首次出现肌酸激酶升高年龄范围为0.3～12.7岁。肌病型患者可有肌红蛋白尿、尿常规异常或伴肾功能异常。多采用10％氢氧化钾溶液，可溶解其他细胞成分，提高假丝酵母菌检出率。
2、串联质谱检测：可发现多种长链酰基肉碱水平增高，其中以肉豆蔻烯酰肉碱(C14∶1)升高最为明显。新生儿筛查结果阳性的可能原因为经典的极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症患者、无症状的极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症患者、无发病风险的携带者、母源性、假阳性。由于线粒体内蓄积的C14～C18酰基辅酶A需与游离肉碱结合形成酰基肉碱而离开线粒体，故极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症患儿可同时有游离肉碱水平降低。要注意的是，禁食后健康人体也会出现C14∶1和C14∶2酰基肉碱升高，这是对脂肪分解的一种生理反应。
3、基因检测：基因突变分析是确诊极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症的金标准，通过对ACADVL 基因的20个外显子设计引物进行PCR和DNA测序寻找突变以明确诊断。
4、酶学检测：单独的分子测序在只发现1个突变或发现新的未知临床相关性突变时，诊断过程将会变得困难，这时可进行功能测试来帮助明确诊断，而通过测定棕榈酰辅酶A的氧化速率来反映VLCAD残余酶活性是有价值的工具。酶学检测可用于成纤维细胞和淋巴细胞。因新生儿采取成纤维细胞需有创皮肤活检，且细胞培养后需进行检测的细胞数量出现延迟，故在淋巴细胞中使用酶测定法更快速、方便。
5、脂肪酸氧化流量分析：长链脂肪酸氧化流量测量采用分析培养的成纤维细胞中油酸的放射状H2O产物。有研究表明，长链脂肪酸氧化流量与极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症临床严重程度之间存在很强的相关性，因此长链脂肪酸氧化流量测量可以预测患者是否可能出现症状。