急性阿米巴肠病最常见病原学诊断方法是进行大便检查，在粪便中检测到滋养体和包囊即可确诊。检测时要注意粪便必须新鲜，因为滋养体在排除后半小时以后就会丧失活动能力，发生形态改变。如果在粪便中检测到伸展伪足活动，吞噬红细胞阿米巴滋养体最具有确诊意义，成形粪便可先直接涂片找包囊。
其他血清学检测，可以做检测特异性抗体。如果特异性IgM抗体阳性，可以提示近期或者现症感染。还可以检测特异性抗原，如果特异性抗原检测阳性，可以作为明确诊断依据。必要时可以做结肠镜检查，取溃疡边缘部分做涂片及活检。如果能检测到滋养体，也可以确诊。