类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病，在治疗中，甲氨蝶呤作为重要的免疫抑制剂，起到很好的疗效。甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎的原理是，作为叶酸还原酶抑制剂，主要抑制二氢叶酸还原酶，而使二氢叶酸不能还原成有生物活性的四氢叶酸，从而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成过程中，一碳基团的转移作用受阻，导致DNA的生物合成受到抑制。

同时，也有对胸腺核苷酸合成酶的抑制作用，但抑制RNA与蛋白质合成的作用则较弱。治疗类风湿关节炎主要是抑制T淋巴细胞的活性，从而抑制不正常的免疫活性。